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申请/专利权人：中国农业大学

摘要：本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体公开了植物EBF1蛋白及其编码基因在构建耐低温植物中的应用。本发明经过研究发现，在植物中过表达EBF1基因能显著提高植物耐低温能力。本发明提供的EBF1蛋白及其编码基因的这一新应用，为培育耐低温植物新品种提供新的种质资源，同时对于研究植物低温应答响应分子机制和提高植物抗逆性研究奠定了一定的理论基础。

主权项：1.EBF1蛋白在构建耐低温植物中的应用，其特征在于，通过提高EBF1蛋白在植物中的表达量，获得耐低温的转基因植物；其中，EBF1蛋白的氨基酸序列为：iSEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或ii由SEQ ID No.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与SEQ ID No.1具有相同功能的氨基酸序列。

全文数据：植物EBF1蛋白及其编码基因在构建耐低温植物中的应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程及分子生物学领域，涉及植物EBF1蛋白及其编码基因在构建耐低温植物中的应用。背景技术[0002]由于植物的不可移动性，植物的生长发育对环境变化及其敏感，当遭受外界非生物逆境胁迫时，影响植物的生长，限制作物的产量。近年来，随着全球气候的极端变化，低温越来越成为一种影响广泛的非生物逆境，对植物的正常生长和农业生产造成了极大的破坏。因此，研究植物响应低温逆境的生理生化变化和分子机理，寻找调控植物低温响应的关键基因，为获得耐低温植物的获得提供重要的理论支持，对提供作物产量有着关键的应用价值。[0003]目前植物分子生物学研究多以拟南芥Arabidopsisthaliana为模式植物进行研宄，拟南芥属于十字花科植物，具有基因组小，生长较快等优势，被广泛用于植物遗传学、细胞生物学、分子生物学等研宄中。以拟南芥为模式植物研宄植物对低温逆境响应的分子机理，可以更快较好的阐述植物低温应答的分子机制，从而为提高培育作物的耐低温植物提供理论依据。一般通过农杆菌侵染或者其他转基因方法的方法，可以将相关基因克隆载体转到野生型拟南芥中，获得该基因的过表达或基因敲除株系，然后再进行植物耐受性实验检测，研宄该基因在相关逆境中的功能，可以得知该基因在相应逆境中发挥的功能，从而发掘耐逆境胁迫基因资源。发明内容[0004]为了解决现有技术的问题，本发明的目的是提供植物EBF1蛋白及其编码基因在构建耐低温植物中的应用。[0005]为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：[0006]本发明首先提供了EBF1蛋白在构建耐低温植物中的应用，具体为:通过提高EBF1蛋白在植物中的表达量，获得耐低温的转基因植物；[0007]其中，EBF1蛋白的氨基酸序列为：[0008]iSEQIDNo.l所示的氨基酸序列；或[0009]ii由SEQIDNo.l经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与SEQIDNo.l具有相同功能的氨基酸序列。[0010]进一步地•本发明提供了EBF1基因（前述EBF1蛋白的编码基因）在构建耐低温植物中的应用，具体为:通过在植物中过表达EBH基因，获得耐低温的转基因植物；[0011]其中，EBF1基因的核苷酸序列为：[0012]iSEQIDNo.2所示的核苷酸序列；[0013]iiSEQIDNo.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列;或[0014]iii在严格条件下与SEQIDNo.2所示序列杂交的核苷酸序列；[0015]SEQIDNo.2所示的EBF1基因由3158个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第257位到第2924位碱基。该基因读码框由2个外显子和1个内含子组成，读码框第1位到第25位碱基，第397位到第2258位碱基为外显子序列，其余为其内含子序列。EBF1基因来源于哥伦比亚生态型拟南芥，在拟南芥基因组数据库中的编号为AT2G25490。[0016]由EBF1基因编码的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。[0017]应理解，考虑到密码子的简并性及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。[0018]前述应用中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物，例如拟南芥等。将植物耐低温EBF1基因在植物中过表达，包括利用任一种可以引导外源基因在植物中过表达的载体进行。[0019]本发明还提供一种构建耐低温的转基因拟南芥的方法，包括以下步骤：[0020]1提取拟南芥总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增EBF1基因，将扩增产物构建到具有35S启动子适合植物基因表达的表达载体，如pC-TAPa载体图谱见图5，获得的重组表达载体35S-EBF1-TAP;[0021]该表达载体含有attRl::ccdB::attR2序列可通过分子克隆Gateway技术插入目的基因；[0022]2用35S-EBF1-TAP转化农杆菌GV3101，然后利用转化的农杆菌侵染拟南芥花序，获得耐低温的转基因拟南芥幼苗。[0023]其中，步骤1中所述引物F和R的核苷酸序列如SEQIDNo.3和4所示。所述拟南芥优选为野生型拟南芥植株，即具有纯合基因型的拟南芥植株。[0024]将本发明的35S-EBF1-TAP基因过表达后，拟南芥表现为耐低温的表型。为了便于对转基因拟南芥植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物等。[0025]本发明通过对编码植物内蛋白激酶的基因EBF1全称为EIN3-BINDINGFBOXPROTEIN1的研究，发现过表达该基因的转基因植株较野生型植株具有明显耐低温的表型。[0026]本发明的有益效果在于：[0027]本发明提供的EBH蛋白及其编码基因为培育耐低温植物新品种提供了基因资源，为研究植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。附图说明[0028]图1为35S:EBF1-TAP软件VectorNTISuite8.0测序结果。[0029]图2为本发明实施例2中过表达株系的EBF1蛋白表达图。[0030]图3为本发明实施例3中过表达株系冷驯化和非冷驯化后低温处理植株恢复情况照片。[0031]图4为本发明实施例3中过表达株系冷驯化和非冷驯化后低温处理植株成活率统计图。[0032]图5为表达载体pC-TAPa结构图谱。具体实施方式[0033]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如gateway分子克隆实验方法（FedericoKatzenetal,SinglestepBPLRcombinedGatewayreactions，2〇13，或按照制造厂商说明书建议的条件。[0034]以下实施例中TOPOTAgateway入门载体为常用的克隆载体，可市购;pC—TAPa载体是由南方科技大学郭红卫教授实验室提供；拟南芥品种为哥伦比亚生态型；农杆菌GV3101菌株常用的克隆载体。[0035]以下实施例中的主要试剂为：gateway分子克隆相关实验产品均购自Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶、T4连接酶、PyrobestTaq酶、K0D、购自NEB、Toyobo等生物公司；dNTPs购自Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司;MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素Amp、卡那霉素Kan、硫酸庆大霉素Gen、利福平Rif等抗生素以及Glucose、BSA、硝酸纤维素膜、LBMedium等购自Sigma、Bi〇-Rad等公司;实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。[0036]实施例中所使用的引物由六合华大公司合成，并进行相关测序。[0037]实施例1EBF1基因过表达载体的构建[0038]根据EBF1基因（拟南芥基因组数据库中的编号为AT2G25490的编码区序列分析，设计特异性引物F和R，将该基因的编码区扩增出来，连接到具有表达载体pC-TAPa上。[0039]所用的引物为：[0040]上游引物F:[0041]5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGTCTCAGATCTTTAGTTTTGCCG-3’（SEQIDNo.3；[0042]下游引物R:[0043]5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGGAGAGGATGTCACATTTGTAAAGA-3’（SEQIDNo.4〇[0044]将EBF1基因连接到载体pC-TAPa上的具体方法为：利用连接到gateway入门载体T0P0TA通过BP及LP反应的得到通过抗性筛选后的阳性克隆菌斑，试剂盒小量提取质粒并送华大基因测序测序。[0045]测序正确表明pC-TAPa载体中已连入EBF1编码区序列，结果如图1。[0046]实施例2EBF1基因过表达植物的构建和检测[0047]将实施例1所述含有EBF1基因的pC-TAPa载体转化到农杆菌GV：3101菌株中，再转入野生型拟南芥植株中，得到拟南芥转基因幼苗。具体方法为:将含有目的载体的农杆菌接种于100mLLB三抗液体培养液，卡那霉素（Kan50ugmL，利福平（Rif50UgmL，庆大霉素Gen5〇ygmL中，28°C振荡培养过夜，待0D_值为1•〇-2.0，以4000rpm，室温离心15min，收集菌体;用200mL转化液（12MS，5%蔗糖，40uLSilwetL-77悬浮菌体;将拟南芥花序浸泡在农杆菌的转化液中lmin，套上保鲜袋保湿并置于黑暗处使其温度较低，第二天将植物从保鲜袋中取出，放回光照培养架上正常生长至收种。[0048]_pC-TAPa载体所带筛选抗性基因为庆大霉素，用庆大霉素抗性对拟南芥转基因幼苗进行筛选，获得的7\代具有庆大霉素抗性的阳性苗进行单株收种，再对T2代种子进行庆大霉素抗性的测试，选择34具有抗性而其余14没有抗性的株系，说明在该株系中连有目的基因的过表达载体以单拷贝形式插入。将这些株系中具有庆大霉素抗性的植株移出，再进行单株收种，用获得的T3代种子进行庆大霉素抗性筛选，如果T4代植株没有分离，说明该转基因株系为纯合体，该纯合体可以用于繁种、低温逆境处理实验。[0049]本实施例中分离得到过表达株系。采用蛋白质免疫印迹方法检测所得过表达株系。[0050]1提取植物总蛋白[0051]将在培养皿上生长的12天幼苗用锡箔纸包好，迅速冻于液氮中备用。用液氮将植物材料磨成粉末状，加入蛋白提取缓冲液和蛋白酶抑制剂，涡旋震荡后于4°C，13000rpm离心15min〇[0052]2蛋白质免疫印迹法检测过表达株系中的蛋白含量[0053]分别取等量的野生型、过表达拟南芥株系的植物蛋白，加入5XSDS蛋白上样缓冲液，100°C煮沸5min，90V电压跑胶15min后，改为120V电压跑胶lh，200mA直流电转膜2h。最后用Anti-Myc抗体检测过表达株系中的蛋白含量。Anti-Actin做为内参。[0054]检测结果见图2,可以看出过表达株系中的目的蛋白表达较强。[0055]在其它植物中过表达EBF1基因的方法可以参考本实施例进行。[0056]实施例3过表达EBF1基因植物的耐低温能力检测[0057]首先将野生型拟南芥幼苗和实施例2中所得的EBF1基因过表达株系〇E-1和0E-2在培养皿上生长12天，然后将其移到低温培养箱内进行冷冻处理。对于冷驯化植物，过表达株系0E-1和0E-2在培养皿上生长12天后移入4°C低温培养箱培养3天后，进行程序降温（1°Ch至所需零下低温处理一定时间。以上处理植株黑暗处理24小时后移入22°C光照培养箱培养3天后统计存活的植物数量，计算存活率。[0058]结果显示（图3和图4，在非冷驯化和冷驯化条件下，0E-1和0E-2均表现抗冻的表型。这说明EBF1过表达植株的耐低温能力得到显著提高。[0059]由此可见，拟南芥E3连接酶EBH过表达后能够显著提高植物对低温的耐受能力。[0060]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.EBF1蛋白在构建耐低温植物中的应用，其特征在于，通过提高EBF1蛋白在植物中的表达量，获得耐低温的转基因植物；其中，EBF1蛋白的氨基酸序列为：iSEQIDNo.l所示的氨基酸序列;或ii由SEQIDNo.l经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与SEQIDNo.l具有相同功能的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物包括但不限于拟南芥。4.EBF1基因在构建耐低温植物中的应用，其特征在于，通过在植物中过表达EBF1基因，获得耐低温的转基因植物；其中，EBF1基因的核苷酸序列为：15£〇10如.2所示的核苷酸序列；iiSEQIDNo.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；iii在严格条件下与SEQIDNo.2所示序列杂交的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物包括但不限于拟南芥。7.—种构建耐低温的转基因拟南芥的方法，其特征在于，包括以下步骤：1提取拟南芥总RNA，反转录获得CDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增EBF1基因，将扩增产物构建到具有35S启动子的植物基因表达载体上，获得的重组表达载体；2将重组表达载体采用农杆菌介导的方式侵染拟南芥花序，获得耐低温的转基因拟南芥植株；其中，步骤1中所述引物F和R的核苷酸序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。8.—种构建耐低温的转基因拟南芥的方法，其特征在于，包括以下步骤：1将SEQIDNo.2所;^的核苷酸序列构建到表达载体pC-TAPa上，获得的重组表达载体35S-EBF1-TAP；2将重组表达载体3SS-EBF1-TAP采用农杆菌介导的方式侵染拟南芥花序，获得耐低温的转基因拟南芥植株。

百度查询： 中国农业大学 植物EBF1蛋白及其编码基因在构建耐低温植物中的应用