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申请/专利权人：中国科学院微生物研究所

摘要：本发明公开了一种将spacer序列克隆至CRISPR‑Cas9系统中的方法及其应用。本发明的方法包括如下步骤：1改造表达sgRNA的载体、设计合成可退火形成带有粘末端片段的单链DNA分子A和单链DNA分子B；2将单链DNA分子A和单链DNA分子B退火，形成带有酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和酶切识别位点B粘末端的片段丙；3将片段丙通过酶切连接替换改造后表达sgRNA的载体中的酶切识别位点A和酶切识别位点B之间的片段，得到重组载体，实现靶基因spacer克隆至表达sgRNA的载体。通过实验证明：本发明提供的方法可以有效并快速的将spacer序列克隆至表达sgRNA的载体。

主权项：一种将靶基因spacer克隆至表达sgRNA的载体中的方法，包括如下步骤：1改造表达sgRNA的载体、设计合成可退火形成带有粘末端片段的单链DNA分子A和单链DNA分子B；所述改造表达sgRNA的载体通过包括如下步骤的方法进行：突变表达sgRNA的载体中第一个回文序列的上游且紧邻回文序列第一个碱基的碱基，使突变后碱基与所述第一个回文序列自5’末端起5个碱基形成能产生粘末端的酶切识别位点B，得到改造后表达sgRNA的载体；所述表达sgRNA的载体中含有如下表达盒：从5’端起依次包括启动子、能产生粘末端的酶切识别位点A和用于结合Cas9蛋白的ncRNA编码DNA分子，所述启动子启动所述ncRNA的表达；且所述表达sgRNA的载体不含有酶切识别位点B；所述单链DNA分子A从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和DNA片段乙组成；所述单链DNA分子B从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点B粘末端、DNA片段乙反向互补片段和靶基因spacer反向互补片段组成；所述DNA片段乙为所述表达sgRNA的载体中位于所述酶切识别位点A和所述第一个回文序列之间的片段；2将所述单链DNA分子A和所述单链DNA分子B退火，形成带有酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和酶切识别位点B粘末端的片段丙；3将所述片段丙通过酶切连接替换所述改造后表达sgRNA的载体中的所述酶切识别位点A和所述酶切识别位点B之间的片段，得到重组载体，实现靶基因spacer克隆至表达sgRNA的载体。

全文数据：一种将spacer序列克隆至CRISPR-Cas9系统中的方法及其应用技术领域[0001]本发明属于基因组编辑技术领域，具体涉及一种将spacer序列克隆至CRISPR-Cas9系统中的方法及其应用。背景技术[0002]基于CRISPRClusteredRegularlyInterspacedSmallPalindromicRepeatSCaS9系统的基因组编辑方法已经彻底改变了人类编辑基因组的历史。CRISPRCas9系统是原核生物中广泛存在的一套针对外源核酸分子入侵的适应性免疫系统，可以抵御噬菌体侵染，消灭偶然转化获得的质粒等。当细胞第一次被攻击后，入侵的DNA的部分序列有规律的整合到事先存在的CRISPR重复序列之间，称为间隔子（spacer。当细胞再次受到攻击时，这段序列被一同转录为小分子RNA——crRNACRISPRRNA。对于CRISPRII型系统，还存在一个小分子RNA--tracrRNA与crRNA形成二聚体，一同被加工、行使功能。与其他类型相比，CRISPRII型系统的结构是最紧凑的：唯一的蛋白酶CAS9在crRNA:tracrRNA双元分子的指导下入侵的DNA双链中形成R-Ioop。蛋白酶CAS9的两个内切酶活位点对DNA进行序列特异的切割。为了正确的识别外源DNA分子，spacer序列下游（5’-3’方向）存在PAMProtospacerAdjacentMotif基序5’_NGG_3’。为了便于载体构建，crRNA:tracrRNA双元分子可以融合为单个的sgRNAsingleguideRNA，其5’端20nt是负责识别特定基因的区域。这样只要同时表达CAS9蛋白和SgRNA就有可能实现基因组编辑。这种基于CRISPRCas9系统的技术不同于以往基于蛋白质的基因组编辑技术，CRISPRCas9系统对DNA进行特异的切割是由小分子RNA介导的，针对不同的靶标基因，只需要设计、替换不同的小分子RNA即可。如何简便的克隆对应的spacer序列就成为应用该系统的关键。[0003]目前已经发表的CRISPRCas9质粒多采用了ΠS型内切酶的策略来克隆spacer序列，因此实现无痕克隆的效果。常见的Π型内切酶由于具备6个碱基的回文结构，往往不利于无痕克隆，因此还没有用于克隆spacer序列。这种方法利用IIS型内切酶识别位点和切割位点不同的特点实现了无痕克隆。但是由于常用的IIS型内切酶数目有限，如BsaI、BbsI、BsmBI和SapI，当把CRISPRCas9系统应用于不同生物时很容易由于载体骨架序列和其他调控原件序列的冲突，出现这些Π型内切酶无法使用的情况，因而有必要开发新的廉价的Spacer克隆方法。发明内容[0004]本发明的一个目的是提供一种将革El基因spacer克隆至表达SgRNA的载体中的方法。[0005]本发明提供的将革El基因spacer克隆至表达SgRNA的载体中的方法包括如下步骤：[0006]1改造表达SgRNA的载体、设计合成可退火形成带有粘末端片段的单链DNA分子A和单链DNA分子B;[0007]所述改造表达SgRNA的载体通过包括如下步骤的方法进行:突变表达SgRNA的载体中第一个回文序列的上游且紧邻回文序列第一个碱基的碱基，使突变后碱基与所述第一个回文序列自5’末端起5个碱基形成能产生粘末端的酶切识别位点B，得到改造后表达SgRNA的载体；[0008]所述表达sgRNA的载体中含有如下表达盒:从5’端起依次包括启动子、能产生粘末端的酶切识别位点A和用于结合Cas9蛋白的ncRNA编码DNA分子，所述启动子启动所述ncRNA的表达;且所述表达sgRNA的载体不含有酶切识别位点B;[0009]所述单链DNA分子A从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和DNA片段乙组成；[0010]所述单链DNA分子B从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点B粘末端、DNA片段乙反向互补片段和靶基因spacer反向互补片段组成；[0011]所述DNA片段乙为所述表达sgRNA的载体中位于所述酶切识别位点A和所述第一个回文序列之间的片段；[0012]2将所述单链DNA分子A和所述单链DNA分子B退火，形成带有酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和酶切识别位点B粘末端的片段丙；[0013]3将所述片段丙通过酶切连接替换所述改造后表达sgRNA的载体中的所述酶切识别位点A和所述酶切识别位点B之间的片段，得到重组载体，实现靶基因spacer克隆至表达sgRNA的载体。[0014]上述方法中，[0015]所述改造表达sgRNA的载体方法中，在所述突变表达sgRNA的载体中第一个回文序列的上游且紧邻回文序列第一个碱基的碱基后还包括如下步骤:突变所述表达sgRNA的载体中第一个回文序列的上游的某个碱基，该碱基与所述回文序列的第一个碱基间隔一个碱基，使突变后的碱基不产生甲基化位点。[0016]上述方法中，[0017]步骤3包括如下步骤:用识别所述酶切识别位点A的酶和识别所述酶切识别位点B的酶酶切所述改造后表达sgRNA的载体，得到带有酶切识别位点A粘末端和酶切识别位点B粘末端的载体骨架;再将所述片段丙与所述载体骨架连接。[0018]上述方法中，所述表达sgRNA的载体可以是addgene网站www.addgene.org上可以购买到的任何一个含有sgRNA序列的载体。[0019]上述方法中，[0020]所述表达sgRNA的载体的核苷酸序列为序列1;[0021]所述第一个回文序列为序列1第3132-3136位所示的核苷酸分子；[0022]所述ncRNA编码DNA分子为序列1第3123-3204位所示的核苷酸分子；[0023]所述酶切识别位点B为XbaI;[0024]所述酶切识别位点A为NcoI;[0025]所述DNA片段乙为序列1第3123-3131位所示的核苷酸分子；[0026]所述改造后表达sgRNA的载体的核苷酸序列为序列2。[0027]上述方法中，[0028]所述表达sgRNA的载体的核苷酸序列为序列3所示的核苷酸分子；[0029]所述第一个回文序列为序列3第3132-3136位所示的核苷酸分子；[0030]所述ncRNA编码DNA分子为序列3第3123-3258位所示的核苷酸分子；[0031]所述酶切识别位点B为AvrΠ;[0032]所述酶切识别位点A为NcoI;[0033]所述DNA片段乙为序列3第3123-3131位所示的核苷酸分子；[0034]所述改造后表达SgRNA的载体的核苷酸序列为序列4。[0035]上述方法中，[0036]所述革El基因spacer可以是基因编辑中革El基因的革El序列；所述革El基因spacer大小为20nt〇[0037]本发明的另一个目的是提供由上述方法制备的重组载体。[0038]本发明还有一个目的是提供由上述方法制备的改造后表达SgRNA的载体。[0039]本发明的最后一个目的是提供上述方法或上述重组载体或上述改造后表达SgRNA的载体的新用途。[0040]本发明提供了上述方法或上述重组载体或上述改造后表达SgRNA的载体在用Cas9基因编辑靶基因中的应用。[0041]本发明的有益效果在于：[0042]1、本发明提供的spacer克隆方法可以使用常规的识别6碱基回文序列的Π型内切酶，降低了对酶切位点的依赖，可以更灵活的选择载体。[0043]2、本发明提供的sgRNAScience,2012,337,816-821与sgRNA2.KNature,2015，517,583-8的构建方法可以兼容现有CRISPR技术对于基因组编辑、表达水平的调节沉默或激活基因表达和单分子成像等用途；[0044]3、本发明提供的方法比原来的spacer克隆方法每条链多合成10个碱基，对于目前的引物合成技术没有任何困难，相比直接全合成sgRNA的策略有成本上的优势。[0045]通过实验证明：本发明提供的将spacer序列克隆至CRISPR_Cas9系统中的方法，可以有效并快速的将spacer序列克隆至Cas9载体。附图说明[0046]图1为SpbS基因spacer克隆至本发明Cas9载体后测序验证图。[0047]图2为SnbS基因spacer克隆至本发明dCas9载体后测序验证图。[0048]图3为SpbS基因敲除后基因型测序验证图。[0049]图4为SnbS基因沉默菌株的表型。具体实施方式[0050]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0051]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0052]实施例1、一种将SpbS基因的spacer序列克隆至Cas9载体中的方法[0053]一、Cas9载体的改造[0054]l、Cas9载体Cas9载体的核苷酸序列为序列1中第一类回文序列为ctaga序列1的第3132-3136位），类似于XbaI的酶切识别位点tctaga，第一类回文序列上游的第一个碱基为g，突变Cas9载体中第一类回文序列上游的第一个碱基为t，使突变后碱基t与第一类回文序列的5个碱基形成能产生粘末端的酶切识别位点XbaItctaga。[0055]上述Cas9载体从5’端起依次包括启动子、能产生粘末端的酶切识别位点NcoI和用于结合Cas9蛋白的ncRNA编码DNA分子序列1第3123-3204位核苷酸），启动子启动ncRNA的表达;且Cas9载体不含有的酶切识别位点XbaI;[0056]上述第一类回文序列为ncRNA编码DNA分子的5’端起第一个回文序列，且由可形成回文序列的6个碱基中的后5个碱基组成。[0057]2、Cas9载体中第一类回文序列上游的第一个碱基突变为t后，由于Cas9载体中第一类回文序列上游的第2个碱基为a，为了避免甲基化，突变Cas9载体中第一类回文序列上游的第二个碱基为g，得到改造后Cas9载体，改造后Cas9载体的核苷酸序列为序列2。[0058]二、设计合成可退火形成带有粘末端片段的单链DNA分子A和单链DNA分子B[0059]I、SpbS基因spacer的设计[0060]针对5口5基因设计的8口3〇61序列如下5’-〇^：111^^^^^0：11'0^-3’。设计的具体步骤如下：[0061]1选择以5’-NGG-3’结尾的23nt序列，包含spacer的20nt和PAM的3nt，将包含连续五个T的序列排除;其中，N是A或T或C或G。[0062]2将3’端的15个碱基，包含spacer的12nt和PAM的3nt，用BOWTIE进行序列比对，排除有多个比对位置的序列；[0063]3将BOWTIE生成的文件进行分析，去除非特异识别的spacer。[0064]2、单链DNA分子A的设计[0065]单链DNA分子A从5’端至3’端依次由酶切识别位点NcoI粘末端、步骤1设计的SpbS基因spacer序列和DNA片段乙（Cas9载体中位于酶切识别位点NcoI和第一类回文序列之间的片段）组成；单链DNA分子A的核苷酸序列如下：5’-catggCCACTCGGGGTGTCCTTCCAgttttaggt-3’〇[0066]3、单链DNA分子B的设计[0067]单链DNA分子B从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点XbaI粘末端、DNA片段乙反向互补片段和SpbS基因spacer序列的反向互补片段组成；单链DNA分子B的核苷酸序列如下：3’-cGGTGAGCCCCACAGGAAGGTcaaaatccagatc-5’〇[0068]4、退火[0069]将单链DNA分子A和单链DNA分子B退火，形成带有酶切识别位点NcoI粘末端、SpbS基因spacer和酶切识别位点XbaI粘末端的片段丙。具体步骤如下：在反应体系中加入IyLΙΟμΜ单链DNA分子A、IyLΙΟμΜ单链DNA分子B，2yLT4连接酶缓冲液，16Λ的ddH20至终体积20yL〇[0070]三、SpbS基因spacer克隆至Cas9载体[0071]1、用Π型内切酶NcoI和XbaI对改造后Cas9载体酶切，得到带有酶切识别位点NcoI粘末端和酶切识别位点XbaI粘末端的载体骨架；[0072]2、将步骤二获得的片段丙与载体骨架连接，片段丙通过酶切连接替换改造后Cas9载体中的酶切识别位点NcoI和酶切识别位点XbaI之间的片段，得到重组载体图1，实现SpbS基因spacer克隆至Cas9载体。[0073]四、SpbS基因的敲除[0074]1、同源臂的克隆[0075]将序列5所示的DNA片段插入重组载体中StuI位点（序列2的第8077-8082位），得到敲除载体，敲除载体的核苷酸序列为序列6。其中，序列5的第1-1009位为SpbS基因同源臂左臂，序列5的第1010-2052位为SpbS基因同源臂右臂。[0076]2、将敲除载体通过链霉菌接合转移方法导入链霉菌（美国ATCC购买，目录号为31271，得到重组菌，并用安普霉素筛选得到阳性克隆。按照文献“ACSSynth.Biol.，2015，49,1020-1029”中的方法来诱导重组菌中Cas9蛋白表达，最终得到SpbS基因敲除菌株。[0077]3、SpbS基因敲除菌株的测序验证[0078]对SpbS基因敲除菌株进行测序验证，测序结果如图3所示，从图中可以看出，同源臂左臂的3’端的序列已经和右臂的5’端的序列已经无缝连接起来，SpbS基因的读码框已经完全不存在，说明SpbS基因已经被完全敲除。[0079]实施例2、一种将SnbS基因的spacer序列克隆至dCas9载体中的方法[0080]一、dCas9载体的改造[0081]dCas9载体dCas9载体的核苷酸序列为序列3中第一类回文序列为ctagg序列3的第3132-3136位），类似于AvrII的酶切识别位点cctagg，第一类回文序列上游的第一个碱基为g，突变dCas9载体中第一类回文序列上游的第一个碱基为c，使突变后碱基c与第一类回文序列的5个碱基形成能产生粘末端的酶切识别位点AvrΠcctagg，得到改造后dCas9载体改造后dCas9载体的核苷酸序列为序列4。[0082]上述dCas9载体从5’端起依次包括启动子、能产生粘末端的酶切识别位点NcoI和用于结合dCas9蛋白的ncRNA编码DNA分子序列3第3123-3258位核苷酸），启动子启动ncRNA的表达;且dCas9载体不含有的酶切识别位点AvrΠ;[0083]上述第一类回文序列为ncRNA编码DNA分子的5’端起第一个回文序列，且由可形成回文序列的6个碱基中的后5个碱基组成。[0084]二、设计合成可退火形成带有粘末端片段的单链DNA分子C和单链DNA分子D[0085]I、SnbS基因spacer的设计[0086]针对5油5基因设计的8口〇61序列如下5’-6：1^6：1^4了661'1'^64：1'-3’。设计的具体步骤如下：[0087]1选择以5’-NGG-3’结尾的23nt序列，包含spacer的20nt和PAM的3nt，将包含连续五个T的序列排除;其中，N是A或T或C或G。[0088]2将3’端的15个碱基，包含spacer的12nt和PAM的3nt，用BOWTIE进行序列比对，排除有多个比对位置的序列；[0089]3将BOWTIE生成的文件进行分析，去除非特异识别的spacer。[0090]2、单链DNA分子C的设计[0091]单链DNA分子C从5’端至3’端依次由酶切识别位点NcoI粘末端、步骤1设计的SpbS基因spacer和DNA片段乙（dCas9载体中位于酶切识别位点NcoI和第一类回文序列之间的片段）组成；单链DNA分子C的核苷酸序列如下：5’-catggGCTTGCTCATGGTTCTGACTgttttaggt-3’。[0092]3、单链DNA分子D的设计[0093]单链DNA分子D从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点AvrΠ粘末端、DNA片段乙反向互补片段和SnbS基因spacer反向互补片段组成；单链DNA分子D的核苷酸序列如下：3’-cCGAACGAGTACCAAGACTGAcaaaatccagatc-5’〇[0094]4、退火[0095]将单链DNA分子C和单链DNA分子D退火，形成带有酶切识别位点NcoI粘末端、SnbS基因spacer和酶切识别位点AvrΠ粘末端的片段丁。具体步骤如下：在反应体系中加入IyLΙΟμΜ单链DNA分子C，IyLΙΟμΜ单链DNA分子D和2yLT4连接酶缓冲液，16yL的ddH20至终体积20yL〇[0096]三、SnbS基因spacer克隆至dCas9载体[0097]1、用Π型内切酶NcoI和AvrΠ对改造后Cas9载体酶切，得到带有酶切识别位点NcoI粘末端和酶切识别位点AvrΠ粘末端的载体骨架；[0098]2、将步骤二获得的片段丁与载体骨架连接，片段丁通过酶切连接替换改造后dCas9载体中的酶切识别位点NcoI和酶切识别位点AvrII之间的片段，得到重组载体（图2，实现SnbS基因spacer克隆至dCas9载体。[0099]将上述SnbS基因的spacer序列替换为gcggctggtaactcactgtg该spacer序列在链霉菌株中无靶点）。其他步骤不变，得到对照载体。[0100]四、SnbS基因的沉默[0101]l、SnbS基因沉默菌株的获得[0102]将步骤三的2获得的重组载体和对照载体分别通过链霉菌接合转移方法导入链霉菌美国ATCC购买，目录号为31271，得到重组菌，并用安普霉素筛选得到阳性克隆。按照文献“ACSSynth.Biol.,2015，49，1020-1029”中的方法来诱导重组菌中dCas9蛋白的表达，最终得到SnbS基因沉默菌株和对照菌株。[0103]2、SnbS基因沉默菌株的表型[0104]SnbS基因也叫IlvH，控制异亮氨酸和缬氨酸合成过程中的关键步骤，对于菌体生长为必须基因，因此该基因沉默后可以观察到菌体生长受到严重抑制。观察SnbS基因沉默菌株和对照菌株的生长情况，以确定是否成功沉默SnbS基因。[0105]结果如图4所示，图4中左侧为对照菌株，对照菌株有大量的白色菌体沉淀在试管底部，呈现正常生长状态;右侧为SnbS基因沉默菌株，SnbS基因沉默菌株管底仅有少量白色菌体，说明SnbS基因沉默菌株中成功沉默了SnbS基因，菌体生长受到抑制。

权利要求：1.一种将革G基因spacer克隆至表达SgRNA的载体中的方法，包括如下步骤：1改造表达sgRNA的载体、设计合成可退火形成带有粘末端片段的单链DNA分子A和单链DNA分子B;所述改造表达sgRNA的载体通过包括如下步骤的方法进行：突变表达sgRNA的载体中第一个回文序列的上游且紧邻回文序列第一个碱基的碱基，使突变后碱基与所述第一个回文序列自5’末端起5个碱基形成能产生粘末端的酶切识别位点B，得到改造后表达sgRNA的载体；所述表达sgRNA的载体中含有如下表达盒:从5’端起依次包括启动子、能产生粘末端的酶切识别位点A和用于结合Cas9蛋白的ncRNA编码DNA分子，所述启动子启动所述ncRNA的表达;且所述表达sgRNA的载体不含有酶切识别位点B;所述单链DNA分子A从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和DNA片段乙组成；所述单链DNA分子B从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点B粘末端、DNA片段乙反向互补片段和靶基因spacer反向互补片段组成；所述DNA片段乙为所述表达sgRNA的载体中位于所述酶切识别位点A和所述第一个回文序列之间的片段；2将所述单链DNA分子A和所述单链DNA分子B退火，形成带有酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和酶切识别位点B粘末端的片段丙；3将所述片段丙通过酶切连接替换所述改造后表达sgRNA的载体中的所述酶切识别位点A和所述酶切识别位点B之间的片段，得到重组载体，实现靶基因spacer克隆至表达sgRNA的载体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述改造表达sgRNA的载体方法中，在所述突变表达sgRNA的载体中第一个回文序列的上游且紧邻回文序列第一个碱基的碱基后还包括如下步骤：突变所述表达sgRNA的载体中第一个回文序列的上游的某个碱基，该碱基与所述回文序列的第一个碱基间隔一个碱基，使突变后的碱基不产生甲基化位点。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤3包括如下步骤:用识别所述酶切识别位点A的酶和识别所述酶切识别位点B的酶酶切所述改造后表达sgRNA的载体，得到带有酶切识别位点A粘末端和酶切识别位点B粘末端的载体骨架;再将所述片段丙与所述载体骨架连接。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述表达sgRNA的载体的核苷酸序列为序列1;所述第一个回文序列为序列1第3132-3136位所示的核苷酸分子；所述ncRNA编码DNA分子为序列1第3123-3204位所示的核苷酸分子；所述酶切识别位点B为XbaI;所述酶切识别位点A为NcoI;所述DNA片段乙为序列1第3123-3131位所示的核苷酸分子；所述改造后表达sgRNA的载体的核苷酸序列为序列2。5.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述表达sgRNA的载体的核苷酸序列为序列3所示的核苷酸分子；所述第一个回文序列为序列3第3132-3136位所示的核苷酸分子；所述ncRNA编码DNA分子为序列3第3123-3258位所示的核苷酸分子；所述酶切识别位点B为AvrΠ;所述酶切识别位点A为NcoI;所述DNA片段乙为序列3第3123-3131位所示的核苷酸分子；所述改造后表达sgRNA的载体的核苷酸序列为序列4。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述革巴基因spacer大小为20nt。7.由权利要求1-6任一所述方法制备的重组载体。8.由权利要求1-6中任一所述方法制备的改造后表达sgRNA的载体。9.权利要求1-6中任一所述的方法或权利要求7所述的重组载体或权利要求8所述的改造后表达sgRNA的载体在用Cas9基因编辑靶基因中的应用。

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