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申请/专利权人：杭州师范大学

摘要：本发明公开了一种苦蘵的组织培养方法，该方法包括以下步骤：种子无菌萌发、诱导愈伤组织、愈伤组织分化、生根培养和炼苗及移栽。本发明的方法用于苦蘵的组织培养，具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，不受季节的限制的优点。

主权项：1.一种苦蘵的组织培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤：1种子无菌萌发：苦蘵种子经酒精、次氯酸钠及吐温灭菌，然后无菌水冲洗，最后均匀播种在12MS培养基上，种子萌发出小苗；培养条件是无菌环境下，培养温度为25±1℃，光周期为16h光照8h黑暗，培养时间为12～14天；2诱导愈伤组织：将种子萌发后小苗的子叶切下，切去叶子两端，然后接种在含有6‑BA和NAA的改良MS培养基上，得到愈伤组织；培养条件是无菌环境下，培养温度为25±1℃，光周期为16h光照8h黑暗，培养时间为35～42天；3愈伤组织分化：将获得的愈伤组织接种在含6‑BA和NAA的改良MS培养基上，得到组培小苗；培养条件是无菌环境下，培养温度为25±1℃，光周期为16h光照8h黑暗，培养时间为14～16天；4生根培养：待愈伤上的不定芽长到2‑3cm时，用剪刀剪下小苗，转接在12MS培养基上，得到生根组培苗；培养条件是无菌环境下，温度为25±1℃，光周期为16h光照8h黑暗，培养时间为12～15天；5炼苗及移栽：待小苗长出白色且粗壮的根后，进行驯化移栽；具体驯化移栽过程是首先在培养室将瓶盖打开炼苗2‑3天，然后取出植株，洗净根部培养基，移栽；炼苗培养条件为往组培瓶中加入0.5‑1cm蒸馏水，打开瓶盖，置于培养温度为25±1℃，光周期为16h光照8h黑暗的培养室中炼苗2‑3天；移栽条件是采用花卉营养土与蛭石的混合物作为培养基质，置于26℃光照培养箱，光周期为16h光照8小时黑暗；所述步骤2、3改良MS培养基的配制方法为：配置1L培养基是将MS培养基固体粉末4.74g、2‑吗啉乙磺酸1g、蔗糖30g，溶解于蒸馏水中，然后将pH值调至5.8～6.0后定容至1L，最后加入1.0‑3.0mgL 6BA和0.05‑0.2mgL NAA，以及8g琼脂粉。

全文数据：一种苦藤的组织培养方法技术领域[0001]本发明涉及植物组织培养技术领域，具体的是一种苦藤的组织培养方法。背景技术[0002]苦藤PhysalisangulataL.又名灯笼泡、灯笼草，为前科酸楽属一年生草本，分布于我国华东、华中、华南及西南；日本、印度、澳大利亚和美洲亦有。常生于海拔500-1500米的山谷林下及村边路旁。苦藤以果、根或全草入药，性味苦、寒，主治咽喉肿痛，腮腺炎，急慢性气管炎，肺脓疡，痢疾，小便不利，外用治脓泡疮等。研究发现苦藤主要有醉茄内酯、酸浆苦素、黄酮、生物碱及留醇等化学成分，其中酸浆苦素和谷留醇具有多种体内外的抗癌活性，对于宫颈癌和皮肤癌都具有明显疗效。苦藤作为一种药用植物，具有潜在抗癌效果，而且还具有生长周期短、单株种子多、近缘物种番茄、马铃薯、辣椒和茄子参考基因组多等特点，便于进行遗传转化和基因功能研究，在作为药用植物基因工程受体模式植物方面具有广阔的前景。[0003]目前关于苦藤的研究报道主要集中在有效成分分析及药理研究方面。苦藤种子的发芽率普遍较低，采用常规的种子繁殖方法速度慢。组织培养技术具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，不受季节的限制等优点，虽然同属植物酸浆和毛酸浆的组织培养研究较多，但对苦藤组织培养的研究和应用微乎其微。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种苦藤的组织培养方法，解决了苦藤因种子发芽率较低而繁殖速度慢的问题。本发明的方法用于苦藤快速繁殖，具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，移栽成活率高的优点。[0005]本发明所提供的技术方案是：[0006]—种苦藤的组织培养方法，包括以下步骤：[0007]1种子无菌萌发:选用饱满的苦藤种子，经酒精、次氯酸钠及吐温灭菌，然后无菌水冲洗，最后均匀播种在12MS培养基上，种子萌发出小苗；[0008]培养条件是无菌环境下，培养温度为25土TC，光周期为16h光照8h黑暗，培养时间为12〜14天；[0009]2诱导愈伤:将种子萌发后小苗的子叶切下，切去叶子两端，然后接种在含有6-BA和NAA的改良MS培养基上，得到愈伤组织；[0010]培养条件是无菌环境下，培养温度为25土TC，光周期为16h光照8h黑暗，培养时间为35〜42天；[0011]⑶愈伤组织分化:将获得的愈伤组织接种在含6-BA和NAA的改良MS培养基上，得到组培小苗；[0012]培养条件是无菌环境下，培养温度为25土TC，光周期为16h光照8h黑暗，培养时间为14〜16天；[0013]4生根培养:待愈伤上的不定芽长到2-3cm时，用剪刀剪下小苗，转接在12MS培养基上，得到根系较为发达的组培苗，主根约有3-4条，根长约为3-5cm。[0014]培养条件是无菌环境下，温度为25±TC，光周期为16h光照8h黑暗，培养时间为12〜15天。[0015]⑸炼苗及移栽:待小苗长出白色且粗壮的根后，进行驯化移栽；[0016]具体驯化移栽过程是首先在培养室将瓶盖打开炼苗2-3天，然后取出植株，洗净根部培养基，移栽。炼苗培养条件为往组培瓶中加入〇.5-lcm蒸馏水，打开瓶盖，置于培养温度为25±TC，光周期为16h光照8h黑暗的培养室中炼苗2-3天。移栽条件是采用体积比为2:1〜3:1营养花卉土与蛭石的混合物作为培养基质，置于26°C光照培养箱，光周期为16h光照8小时黑暗。[0017]其中，步骤（1中所述灭菌方法为混合消毒剂灭菌，具体是种子先在95%乙醇（即上述的酒精）中浸泡3-6分钟，再加入15-25%酒精体积的次氯酸钠、0.1-0.2%酒精体积的吐温20,浸泡15-25分钟。[0018]其中，步骤⑵中所述改良MS培养基的配制方法为:配置IL培养基是将MS培养基固体粉末4·74g、2_吗啉乙横酸MES,2-[N-morphoIino]ethansulfonicacidlg、鹿糖30g，溶解于蒸馏水中，然后将pH值调至5.8〜6.0后定容至IL，最后加入一定浓度的6-BA和NAA，以及8g琼脂粉。[0019]其中，步骤⑴和4中所述12MS培养基的配制方法为:配置IL培养基是将MS培养基固体粉末2.37g、蔗糖30g，溶解于蒸馏水中，然后将pH值调至5.8〜6.0后定容至1L，最后加入8g琼脂粉。[0020]其中，步骤⑵和⑶中所用诱导愈伤和不定芽的不同浓度培养基为15+6-8六1.0-3·OmgL+NAA0·05-0·2mgL。[0021]其中，步骤⑷中所述生根组培苗为真叶已长出，主根约有3-4条，根长约为3-8cm的苗。[0022]本发明的优点是：[0023]1.本发明的方法具有繁殖速度快、繁殖系数大的优点。[0024]2.本发明的方法具有繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状的优点。[0025]3.本发明的方法具有不受季节限制的优点。苦藤在野外为一年生草本，花果期5-12月，而在实验室，通过组织培养得到的组培苗，栽种在培养室一年四季均可开花结果。附图说明[0026]图1为本发明苦藤组织培养体系不同阶段；其中A:苦藤种子0天;B:苦藤2周的小苗;C:叶盘0天;D:叶盘21天;E:叶盘32天;F:芽生根培养12天;G:幼苗;H:苦藤组培植株;I:组培苗花与果，图中标尺为lcm。[0027]图2为本发明实施例中9个激素组合的出芽率情况;其中9个组合的基本培养基均为MS培养基。具体实施方式[0028]下面结合具体例对本发明作进一步详细的说明。[0029]实施例I:[0030]以饱满苦藤种子为试验材料，材料为浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室收集的浙江浦江野生种源，种植在杭州师范大学下沙校区试验地，取成熟果实后剥开，洗出种子，硅胶干燥并保存于实验室4°C冰箱备用，并按照如下所述步骤进行培养，如图1具体步骤如下：[0031]1种子无菌萌发:选取颗粒饱满的种子进行试验。种子在95%乙醇中摇晃浸泡5min。再加入20%酒精体积的次氯酸钠，0.1%酒精体积的吐温20，继续浸泡20min。倒净液体后，用无菌的ddH20清洗种子3-5次。将种子均匀播种在含12MS培养基的玻璃培养皿上，用ParafiIm膜封口后置于培养室中进行培养，培养温度为25±1°C，光周期为16h光照8h黑暗，培养2周左右，待长出真叶，获得无菌苗，用于后续实验。[0032]2愈伤诱导分化培养:选取苦藤种子萌发2周时的幼苗子叶为外植体。用剪刀剪去子叶两端，接种于培养基MS+6-BAlmgL-3mgL+NAA0.05mgL-0·2mgL上。植物激素6-BA和NAA组合共设9个梯度，每梯度设3个重复，每重复接种30个叶盘。置于培养室中进行培养，培养条件同上。1周左右叶盘开始加厚，进一步培养3周左右，愈伤组织表面开始分化出绿色芽点，并进一步发育形成不定芽。40天后统计愈伤诱导率和愈伤出芽率。[0033]3生根培养:待愈伤上的不定芽长到2-3cm时，用剪刀剪下小苗，转接在12MS培养基上，生根率可达100%。2周左右植株即可形成粗壮的根系，主根3-5条，长3-8cm。[0034]⑷炼苗及移栽:待小苗长出白色且粗壮的根后，进行驯化移栽，。首先在培养室将瓶盖打开炼苗2-3天，然后取出植株，洗净根部培养基，移栽。移栽条件:营养花卉土:蛭石体积比为3:1，光照培养箱，16h光照，8小时黑暗，26°C。[0035]上述实施例中所涉及的公式如下：[0036]诱导率（％=诱导出愈伤的叶盘数接种的叶盘数X100%[0037]出芽率（％=长出芽的愈伤数接种的愈伤数X100%[0038]表1[0040]*9个组合的基本培养基为MS培养基，表中不同小写字母表示各处理间差异显著水平P〈0.05。[0041]本研究结果表明苦藤种子在12MS培养基中萌发可培养出适于后续试验的健康子叶；诱导愈伤和不定芽的最佳培养基为MS+6BA3mgL+NAA0.05mgL，愈伤诱导率达100%，愈伤出芽率为78%;将生长良好的2-3cm的不定芽插在12MS生根培养基中，两周左右可形成较好的根系，生根率可达100%图2。[0042]实施例2:[0043]以饱满苦藤种子为试验材料，材料为浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室收集的浙江浦江野生种源，种植在杭州师范大学下沙校区试验地，取成熟果实后剥开，洗出种子，硅胶干燥并保存于实验室4°C冰箱备用，并按照如下所述步骤进行培养，具体步骤如下：[0044]1种子无菌萌发:选取颗粒饱满的种子进行试验。种子在95%乙醇中摇晃浸泡5min。再加入20%酒精体积的次氯酸钠，0.1%酒精体积的吐温20，继续浸泡20min。倒净液体后，用无菌的ddH20清洗种子3-5次。将种子均匀播种在含12MS培养基的玻璃培养皿上，用ParafiIm膜封口后置于培养室中进行培养，培养温度为25±1°C，光周期为16h光照8h黑暗，培养12天左右，待长出真叶，获得无菌苗，用于后续实验。[0045]2愈伤诱导分化培养:选取苦藤种子萌发2周时的幼苗子叶为外植体。用剪刀剪去子叶两端，接种于培养基MS+6-BA3mgL+NAA0.05mgL上，培养35天左右，愈伤组织表面开始分化出绿色芽点，并进一步发育形成不定芽。[0046]3生根培养:待愈伤上的不定芽长到2-3cm时，用剪刀剪下小苗，转接在12MS培养基上，生根率可达100%。12天左右植株即可形成粗壮的根系，主根3-5条，长3-8cm。[0047]4炼苗及移栽:待小苗长出白色且粗壮的根后，进行驯化移栽。首先在培养室将瓶盖打开炼苗2-3天，然后取出植株，洗净根部培养基，移栽。移栽条件是营养花卉土:蛭石体积比为2:1，光照培养箱，16h光照8小时黑暗，26°C。[0048]本研究结果表明苦藤种子在12MS培养基中萌发可培养出适于后续试验的健康子叶；愈伤诱导率达100%，愈伤出芽率为81%;将生长良好的2-3cm的不定芽插在12MS生根培养基中，两周左右可形成较好的根系，生根率可达100%。[0049]实施例3:[0050]以饱满苦藤种子为试验材料，材料为浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室收集的浙江浦江野生种源，种植在杭州师范大学下沙校区试验地，取成熟果实后剥开，洗出种子，硅胶干燥并保存于实验室4°C冰箱备用，并按照如下所述步骤进行培养，具体步骤如下：[0051]1种子无菌萌发：选取颗粒饱满的种子进行试验。种子在95%乙醇中摇晃浸泡5min。再加入20%酒精体积的次氯酸钠，0.1%酒精体积的吐温20，继续浸泡20min。倒净液体后，用无菌的ddH20清洗种子3-5次。将种子均匀播种在含12MS培养基的玻璃培养皿上，用ParafiIm膜封口后置于培养室中进行培养，培养温度为25±1°C，光周期为16h光照8h黑暗，培养13天左右，待长出真叶，获得无菌苗，用于后续实验。[0052]2愈伤诱导分化培养:选取苦藤种子萌发2周时的幼苗子叶为外植体。用剪刀剪去子叶两端，接种于培养基MS+6BA3mgL+NAA0.05mgL上，培养42天左右，愈伤组织表面开始分化出绿色芽点，并进一步发育形成不定芽。[0053]3生根培养:待愈伤上的不定芽长到2-3cm时，用剪刀剪下小苗，转接在12MS培养基上，生根率可达100%。12天左右植株即可形成粗壮的根系，主根3-5条，长3-8cm。[0054]4炼苗及移栽:待小苗长出白色且粗壮的根后，进行驯化移栽。首先在培养室将瓶盖打开炼苗2-3天，然后取出植株，洗净根部培养基，移栽。移栽条件是营养花卉土:蛭石体积比为2.5:1，光照培养箱，16h光照8小时黑暗，26°C。[0055]本研究结果表明苦藤种子在12MS培养基中萌发可培养出适于后续试验的健康子叶；愈伤诱导率达100%，愈伤出芽率为74%;将生长良好的2-3cm的不定芽插在12MS生根培养基中，两周左右可形成较好的根系，生根率可达100%。[0056]上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

权利要求：1.一种苦藤的组织培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤：1种子无菌萌发:苦藤种子经酒精、次氯酸钠及吐温灭菌，然后无菌水冲洗，最后均匀播种在I2MS培养基上，种子萌发出小苗；培养条件是无菌环境下，培养温度为25±TC，光周期为16h光照8h黑暗，培养时间为12〜14天；2诱导愈伤组织:将种子萌发后小苗的子叶切下，切去叶子两端，然后接种在含有6-BA和NAA的改良MS培养基上，得到愈伤组织；培养条件是无菌环境下，培养温度为25±TC，光周期为16h光照8h黑暗，培养时间为35〜42天；3愈伤组织分化:将获得的愈伤组织接种在含6-BA和NAA的改良MS培养基上，得到组培小苗；培养条件是无菌环境下，培养温度为25±TC，光周期为16h光照8h黑暗，培养时间为14〜16天；⑷生根培养:待愈伤上的不定芽长到2-3cm时，用剪刀剪下小苗，转接在12MS培养基上，得到生根组培苗；培养条件是无菌环境下，温度为25±TC，光周期为16h光照8h黑暗，培养时间为12〜15天；⑸炼苗及移栽:待小苗长出白色且粗壮的根后，进行驯化移栽；具体驯化移栽过程是首先在培养室将瓶盖打开炼苗2-3天，然后取出植株，洗净根部培养基，移栽;炼苗培养条件为往组培瓶中加入0.5-1cm蒸馏水，打开瓶盖，置于培养温度为25±TC，光周期为16h光照8h黑暗的培养室中炼苗2-3天;移栽条件是采用花卉营养土与蛭石的混合物作为培养基质，置于26°C光照培养箱，光周期为16h光照8小时黑暗；所述步骤⑵、⑶改良MS培养基的配制方法为：配置IL培养基是将MS培养基固体粉末4.74g、2-吗啉乙磺酸lg、鹿糖30g，溶解于蒸馏水中，然后将pH值调至5.8〜6.0后定容至IL，最后加入1.0-3.011^1684和0.05-0.211^1熟4，以及88琼脂粉。2.如权利要求1所述的一种苦藤的组织培养方法，其特征在于步骤（1中所述灭菌方法为混合消毒剂灭菌，具体是种子先在酒精中浸泡3-6分钟，再加入15-25%酒精体积的次氯酸钠、O.I-0.2%酒精体积的吐温20，浸泡15-25分钟。3.如权利要求1所述的一种苦藤的组织培养方法，其特征在于步骤（1和4中所述12MS培养基的配制方法为:配置IL培养基是将MS培养基固体粉末2.37g、蔗糖30g，溶解于蒸馏水中，然后将pH值调至5.8〜6.0后定容至1L，最后加入8g琼脂粉。4.如权利要求1所述的一种苦藤的组织培养方法，其特征在于步骤4中所述的生根组培苗为真叶已长出，主根有3-4条，根长为3-8cm的苗。5.如权利要求1所述的一种苦藤的组织培养方法，其特征在于6BA的浓度为3.OmgL;NAA的浓度为0.05mgL。6.如权利要求1所述的一种苦藤的组织培养方法，其特征在于步骤5移栽培养基为体积比为2:1〜3:1的花卉营养土与蛭石混合物。

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