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申请/专利权人：杭州科兴生物化工有限公司

摘要：本发明涉及一种鉴别苦蘵的核苷酸序列、特异性引物和方法。本发明鉴别苦蘵的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。用于鉴别苦蘵的特异性引物上游序列ST3KZF：如SEQ ID NO.2所示；下游序列ST3KZR：如SEQ ID NO.3所示。利用特异性引物ST3KZFST3KZR，通过常规PCR方法来鉴别苦蘵。本发明样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作；准确、灵敏度高，ST3KZFST3KZR为苦蘵特异性扩增引物，若为其他酸浆属植物种类，为阴性反应；方法简便，采用PCR技术进行检测，耗时短，3～5小时即可完成。

主权项：1.一种鉴别苦蘵的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

全文数据：一种鉴别苦藤的核苷酸序列、特异性引物和方法技术领域[0001]本发明属于利用分子生物学方法鉴别苦藤的技术领域，涉及一种鉴别苦藤的核苷酸序列、特异性引物及其方法。背景技术[0002]苦藤（PhysalisangulataL.，为前科（Solanaceae酸楽属（Physalis—年生草本植物，分布于世界热带与亚热带地区，常生于海拔500〜1500米。在我国主要分布于华东、华中、华南及西南等地。作为传统药材，几个世纪以来，苦藤以果、根或全草入药，可用于多种疾病的治疗，早在秦汉时期的《尔雅》中就有记载，很多中药材地方志中均有对其描述。其性味苦、寒，主治咽喉肿痛、腮腺炎、急慢性气管炎、肺脓疡、痢疾、小便不利和外用治脓泡疮等。现代医学研究表明苦藤主要有醉茄内酯、酸浆苦素、黄酮、生物碱及留醇等化学成分，其中酸浆苦素和谷留醇具有多种体内外的抗癌活性，对于宫颈癌和皮肤癌都具有明显疗效。另外，苦藤果实中的多糖对超氧阴离子自由基和二苯代苦味自由基起抗氧化作用，苦藤提取液具有抗菌消炎、降血糖、降血脂等疗效。[0003]苦藤与小酸楽？.111；[11；[1]^、酸楽？.311^1^1^；[及毛酸楽？4油6806118等其他酸楽属植物的形态学特征非常相似包括茎、叶、花及果实等特征），因此，利用传统形态学分类方法很难将苦藤与其他酸浆属相似植物快速准确的鉴别开。所以，在过去，将其他酸浆属植物误认为苦藤进行使用的情况经常发生，这为苦藤药材资源的安全使用和保护带来了困难。[0004]随着生物科学的发展，DNA分子标记技术弥补和克服了传统鉴别方法的一些缺陷和难题，已经成为了植物辅助鉴别的重要手段。本申请人运用目标起始密码子多态startcodontargetedPolymorphism,SCoT分子标记方法，对苦藤及其他一些酸楽属植物进行DNA指纹图谱研究，从中筛选出苦藤特异性DNA片段，通过TA克隆、测序等方法，设计发明了特异性引物，应用于苦藤的鉴定，为有效的鉴别和保护苦藤药材资源提供有效的分子技术依据。发明内容[0005]本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种鉴别苦藤的核苷酸序列。[0006]本发明用于鉴别苦藤的特征性核苷酸序列来源于SCoT通用引物35’-CAACAATGGCTACCACCG-3’）扩增所得的苦藤特异性DNA片段，具体序列为：[0007]CGGTGGTAGCCATTGTTGjnSEQIDNO.l**;[0008]本发明的第二个目的是提供基于上述鉴别苦藤的核苷酸序列设计的用于鉴别苦藤的特异性引物ST3KZFST3KZR，该特异性引物序列如下：[0009]上游引物ST3KZF:5’-GCACCTCGCAATACCGCACA-3’，如SEQIDN0·2所示；[0010]下游引物ST3KZR:5’-TCCCCAACTCGAATCAACCG-3’，如SEQIDN0·3所示。[0011]上述特异性引物ST3KZFST3KZR，具有极高的专一性，仅与苦藤发生反应，而不与其他酸浆属植物样品反应。利用该特异性引物通过常规PCR扩增可以快速的对苦藤进行鉴别。[0012]本发明的第三个目的是提供利用上述特异性引物ST3KZFST3KZR进行鉴别苦藤的方法。[0013]本发明采用上述引物组合（ST3KZFST3KZR作为特异性扩增引物，以苦藤基因组DNA为模板，经PCR扩增，电泳检测，获得清晰的苦藤特异性条带，实现对苦藤的快速鉴别。[0014]本发明具有的有益效果：[0015]1样品用量少，只需少量样品材料就可以完成整个操作；[0016]2准确、灵敏性高，ST3KZFST3KZR为苦藤专一性扩增引物，若为其他酸浆属植物种类，为阴性反应；[0017]⑶方法简便，采用PCR技术进行检测，时间短，3-5小时即可完成。附图说明[0018]图1是本发明所述的苦藤的特异性核苷酸序列及对苦藤特异性引物ST3KZF和ST3KZR的位置图，左侧为5’端，右侧为3’端，其中黑色部分为特异性引物ST3KZF和ST3KZR扩增的序列片段大小及位置；[0019]图2是采用SCoT引物3按照常规PCR方法对酸浆属植物进行PCR反应后的电泳图（箭头所指的条带是苦藤特有的条带，分子量为1404bp，其中通道1〜4:小酸楽P.minima;5〜13:苦藤P.angulata;14〜17:酸楽P.alkekengi;18〜20:毛酸楽P.pubescens;M为DNA分子量标准markerDL2000;[0020]图3是利用本发明设计的特异性引物ST3KZFST3KZR对酸浆属植物样品进行检测的PCR产物电泳图，其中通道1〜4:小酸楽P.minima;5〜13:苦藤P.angulata;14〜17:酸楽P·alkekengi;18〜20:毛酸楽P·pubescens;M为DNA分子量标准markerDL2000;具体实施方式[0021]本发明可以从分子水平上较为客观准确的鉴别苦藤，通过以下实施例对本发明做进一步说明：[0022]实施例1:苦藤特征性核苷酸序列的制备[0023]1.基因组DNA的提取[0024]剪取酸浆属植物样品（见表1新鲜叶片IOOmg放入研钵中，立即加入液氮研磨至粉末，然后使用上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，用0.8%琼脂糖胶对所得DNA进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，稀释至50ngyl。[0025]表1.发明实验中所用的酸浆属植物样品[0028]2.SCoT-PCR反应，电泳检测[0029]利用SCoT通用引物35’-CAACAATGGCTACCACCG-3’）进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，反应体系（总体积20μ1为：10XBuffer2μ1,MgCl225mM2μ1，dNTPsIOmM0·8μ1，SCoT引物3ΙΟμΜΙμΐ，0·5μ1Taq酶（2UAU，Ιμΐ模板DNA50ngyl，12.7μ1ddH20〇[0030]PCR反应程序为：94°C预变性5min;35个循环（94°C变性50s，51°C退火50s，72°C延伸1.5min;最后于72°C下延伸lOmin。[0031]PCR产物电泳结果见图2,箭头标的条带（分子量为1404bp，通道5〜13，是采用SCoT引物3进行PCR扩增时筛选出的苦藤特征性条带。如图2图中，通道1〜20为来自4种不同酸楽属植物的样品，编号如表1，具体见附图说明；通道M为DNA分子量标准markerDL2000所示，仅苦藤通道5〜13在分子量1404bp位置有条带出现，而其他酸浆属植物在分子量1404bp位置没有条带出现。因此，此条带为苦藤的特有条带。[0032]3.序列测定[0033]运用SCoT通用引物3进行PCR扩增结束后，用1.5%琼脂糖对PCR产物进行凝胶电泳，对只在苦藤中出现的特异SCoT片段（图2中箭头所指片段进行切胶，采用PCR产物纯化试剂盒上海生工）回收纯化所切DNA片段。然后将所纯化的DNA片段连接到PUCm-T载体上海生工）上，转化到大肠杆菌感受态细胞中，然后送生物公司测序上海生工），得到如SEQIDNO.1所示的核苷酸组成和排列。[0034]实施例2:苦藤特异性引物ST3KZFST3KZR的制备，PCR扩增，电泳检测[0035]在获得苦藤特异性核苷酸序列的基础上，利用PrimerPrimer5.0软件设计得出ST3KZFST3KZR的核苷酸序列（分别为SEQIDN0.2、SEQID勵.3所示的），引物由上海生工生物工程有限公司合成。然后利用设计合成的引物ST3KZFST3KZR，对不同酸浆属植物样品具体见附图说明）进行扩增检测。[0036]PCR反应体系（总体积20μ1为：IOXBuffer2μ1,MgCl225mM2μ1，dNTPsIOmM0·8μ1，引物ST3KZFΙΟμΜΙμΐ，引物ST3KZRΙΟμΜΙμΐ，模板DNA50ngAilΙμΐ，Taq酶（2υμ10·5μ1，ΜΗ2〇11·7μ1。[0037]PCR反应程序为94°C预变性5min;35个循环94°C变性50s，65°C退火50s，72°C延伸1.5min;最后于72°C下延伸lOmin。[0038]PCR产物利用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳图如图3所示，从图3图中，通道1〜12为来自4种不同酸浆属物种的样品，具体见附图说明；通道M为DNA分子量标准markerDL2000可以看出，仅苦藤通道5〜13能扩增出特异性片段，而其他酸浆属植物种类没有扩增出任何条带，这表明本发明的特异性引物具有极高的专一性，因此可以用于快速的鉴别苦藤。将苦藤的特异性片段送去测序，其序列如SEQIDNO.1的53〜1154位碱基所示，其长度为ll〇2bp，具体序列信息见图1。

权利要求：1.一种鉴别苦藤的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。2.基于如权利要求1所述的一种鉴别苦藤的核苷酸序列设计的特异性引物ST3KZFST3KZR，其特征在于该特异性引物序列如下：上游引物ST3KZF如SEQIDN0:2所示；下游引物ST3KZR如SEQIDN0:3所示。3.—种鉴别苦藤的方法，其特征在于采用权利要求2所述的特异性引物ST3KZFST3KZR作为PCR引物，利用PCR方法鉴别苦藤，具体步骤按常规PCR方法进行。

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