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申请/专利权人：中农常乐（深圳）生物育种技术有限公司

摘要：一种水稻孕穗期稳定表达的耐冷基因qCT-3-2HHZ及其分子标记方法，属于水稻高产抗逆育种和分子遗传学领域。根据连锁及连锁不平衡现象，利用“黄华占”与8个多样性丰富的供体亲本衍生的相互关联的育种群体，采用全基因组关联分析及物理作图方法，精细定位和验证孕穗期稳定性表达耐冷性基因qCT-3-2HHZ，进一步开发基于普通PCR的实用经济型标记ZCT-7。将本发明应用于水稻耐冷害的辅助选择育种和聚合育种，能够有效的弥补以往自然变异基因的不足，不但可以显著降低利用初定位结果开展辅助育种带来的负面影响，而且可以在苗期对低世代的育种群体进行基因型选择，获得耐冷个体，便于及时的杂交转育，省去成株期低温抗性鉴定的过程，提高育种效率，加快育种进程。

主权项：一种水稻孕穗期稳定表达的耐冷基因qCT‑3‑2HHZ，其特征在于：在水稻基因组第3染色体1823958‑2150858bp的区间内存在一个与孕穗期耐冷相关的一个基因位点qCT‑3‑2，优质籼稻品种“黄华占”在该位点上的等位基因能够显著增加水稻在孕穗期的耐冷性且为稳定性表达。

全文数据：一种水稻孕穗期稳定表达的耐冷基因qCT-3-2HHZ及其分子标记方法技术领域本发明涉及一个水稻孕穗期稳定表达耐冷基因qCT-3-2HHZ及其分子标记，该基因显著增加水稻在孕穗期的耐冷性，降低产量损失，属于水稻高产抗逆育种和分子遗传学领域，适用于在水稻高产抗逆育种中引入在孕穗期稳定性表达基因qCT-3-2HHZ，并利用分子标记对该基因进行辅助选择育种。背景技术冷害是造成水稻产量损失，限制水稻种植分布的最重要非生物胁迫因素之一。当前，冷害频繁发生，中国每年因冷害造成的损失高达300-500万吨。分子遗传学研究表明，水稻对低温的抗性是受多基因控制的数量性状。与种子发芽期、苗期等时期相比，水稻在孕穗期生殖期具有耐冷性是最为重要的。迄今，已有59个孕穗期生殖期耐冷QTL被鉴定出来，可解释的表型变异率从0.8％到37.8％。在这59QTLs中，只有qCT8，qCT7和qLTB3等少数被精细定位，Ctb1被克隆。上述促使水稻在孕穗期具有耐冷性的等位基因主要来源于自然变异，这些基因的定位和克隆有助于我们了解水稻对低温抗性遗传基础，但其真正在育种实践中成功应用的事例仍十分有限。因此，挖掘具有稳定性表达的耐冷基因具有重要意义。过去几十年来，基于双亲本衍生群体的连锁作图是定位基因的常用策略，其具有统计检验能力强但分辨率低的特点。随着测序技术的发展和自然群体的应用，关联分析associationstudy方法克服了传统群体分辨率低的缺点，但统计检测能力却下降。巢式关联定位NestedassociationmappingNAM是近些年发展起来的一种更优异的数量基因鉴定方法，其合并了连锁分析和关联分析的优点，不仅分辨率高而且统计检验能力强。当前，该方法已经在异交作物玉米和高粱，自交作物大麦上被成功应用于QTL的定位，涉及到病害抗性、农艺、种子成分、碳氮代谢及耐淹胁迫等多个性状。但水稻中尚未有利用该策略进行基因鉴定的报道。利用大规模回交策略开展水稻分子遗传与分子育种相结合研究是本课题组的优势之一。通过该策略，我们已经成功地鉴定到一些重要的非生物胁迫相关的位点，涉及到耐盐，耐旱，耐冷等性状，同时获得一批抗逆性提高的株系。基于这些丰富的经验，水稻中的第一个相互关联的育种定位群体由我们实验室发展。该群体类似于NAM群体，由一个受体亲“黄华占”和8个多样性的供体亲本IR64、PSBRC28、PSBRC66、IR50、Phalguna、OM1723、CDR22和特青衍生而来，共计8个家系497个株系。“黄华占”是中国南方稻区广泛种植的优质常规籼稻，8个供体亲本分别收集自菲律宾、印度、越南和中国。高通量测序表明，亲本和497个家系的平均测序深度分别是25X和3.16X。本发明通过全基因组关联分析并结合物理作图法精细定位到一个位于第3染色体上的孕穗期稳定表达耐冷位点qCT-3-2HHZ，4个环境下其平均贡献率是5.9％。来自“黄华占”的等位基因可显著提高水稻孕穗期的耐冷性，而供体亲本Phalguna和PSBRc28的等位基因则对冷害敏感。进一步的验证试验表明，Indel标记ZCT-7与稳定表达耐冷位点qCT-3-2HHZ紧密连锁，可直接应用于水稻耐冷的标记辅助选择育种。从亲本重测序获得的200万个SNP标记中，筛选41,754个高质量SNP最小等位基因频率＞0.05，缺失率＜10％用于后续耐冷性QTL的鉴定。在2013年，我们发现第3染色体短臂上存在一个与孕穗期耐冷显著相关的位点qCT-3-2，其在两个试验点云南寻甸和玉溪均被定位到。在2014年，我们进一步开展了两地点云南寻甸和嵩明验证试验，结果再次鉴定到该位点。这表明qCT-3-2是一个不受环境影响的呈现稳定表达的孕穗期耐冷QTL。综合分析四个环境的定位结果，qCT-3-2被初步定位到428.2Kb的最大物理区间。效应分析表明，来自受体亲本“黄华占”的等位基因可显著提高水稻孕穗期的耐冷性，4个环境下的平均贡献率是5.9％，而供体亲本Phalguna和PSBRc28的等位基因则对冷害敏感。基于全基因组高密度SNP的优势，覆盖初定位区间的近等基因系被筛选。通过利用饱和密度的SNP标记40万精细分析这些近等基因系在qCT-3-2位点的基因型并结合田间表型数据，qCT-3-2HHZ被精细定位到第3染色体SNPchr031823958和chr032150858之间，参考日本晴序列其物理距离为192.6kb。高分辨率作图表明，qCT-3-2HHZ与前人定位到的qPSST-3存在局部的重叠，鉴于有利等位基因的供体亲本不同，qCT-3-2HHZ的定位区间更小且呈现出不受环境影响的稳定表型特征，因此推断qCT-3-2HHZ可能是一个新的耐冷基因。发明内容为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一个水稻孕穗期耐冷稳定表达基因qCT-3-2HHZ及其分子标记方法。本发明利用“黄华占”和8个供体配制的相互关联的育种群体，通过全基因组关联分析和物理作图，在水稻第3染色体上精细定位了孕穗期稳定表达耐冷基因qCT-3-2HHZ。基于PCR的实用经济型标记ZCT-7也被发展，利用其可有效地开展水稻孕穗期耐冷的分子辅助选择育种研究。本发明的技术方案如下：水稻孕穗期稳定表达耐冷基因qCT-3-2HHZ，在水稻参考基因组日本晴第3染色体1823958-2150858bp的区间内存在一个与孕穗期耐冷相关的一个新基因位点qCT-3-2HHZ，其具有不受环境影响稳定性表达的特征，“黄华占”在该位点上的等位基因能够显著增加孕穗期耐冷性。qCT-3-2HHZ的分子标记方法，其特征在于：用一对特异的PCR引物对ZCT-7，其中正向引物序列为：GGATGGTAGATTAGAAACG，反向引物序列为：ATACTACCCGAATTGTCAC，共同扩增带有品种“黄华占”血缘的育种材料基因组DNA，如果引物ZCT-7能够PCR扩增出与“黄华占”类似的179bp左右大小的片段，那么推测该育种材料很可能含有qCT-3-2HHZ的耐冷等位基因。通过本发明鉴定到第3染色体上的孕穗期稳定表达耐冷基因qCT-3-2HHZ以及可对其进行利用的分子方法。本发明与现有技术相比具有以下优点及效果：1.与目前报道的影响孕穗期耐冷基因qCT8、qCT7、qLTB3和Ctb1不同，qCT-3-2HHZ是源于优质籼稻品种“黄华占”的具有稳定性表达的位点，丰富了自然变异基因的多样性。2.通过紧密连锁分子标记的筛选，能够获得孕穗期耐冷性增强的育种材料。3.本发明的分子标记可用于苗期育种群体的基因型选择，有效地鉴别带有该基因的耐冷型个体，便于及时的杂交转育，加快育种进程。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1孕穗期耐冷QTL的定位图Manhattanplot图。大写字母A、B、C和D分别表示XD2013、YX2013、XD2014和SM2014。图2qCT-3-2HHZ的物理位置。黑色条带代表第3染色体，白色代表纯合HHZ基因型，轮回亲本基因组百分比RGP指各近等基因系中“黄华占”基因组所占的比率，大写字母A和B表示相应的株系间结实率存在极显著差异P≤0.01。图3使用Indel标记ZCT-7对H8家系PCR扩增后的产物在4％琼脂糖凝胶电泳的带型1-14为随机选取的株系；M为DNALadder；P1为耐冷亲本“黄华占”；P2为敏感亲本Phalguna；a为179bp，b为171bp。图4H8家系内51个株系根据Indel标记ZCT-7进行选择后的两种纯合基因型个体的平均结实率。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行进一步说明。实施例1一耐冷基因定位1.供试材料黄华占、IR64PSBRC28、PSBRC66、IR50、Phalguna、OM1723、CDR2和特青以及黄华占与后8个亲本供体亲本配制的相互关联的育种群体，该群体由8个家系组成的共计497个株系组成。2.测序及SNP筛选使用DNeasyPlantMiniKitQiagen试剂盒进行9个亲本和群体的DNA提取。重测序和序列比对均由华大基因科技有限公司完成。以最小等位基因频率MIF＞0.05，缺失率missingdata＜10％为筛选标准，本课题组使用SAMtools工具完成高质量高密度SNP筛选并实施试验材料的基因型分析。3.全基因组关联分析先将群体的SNP基因型数据输入作图软件TASSEL5.2，评估连锁不平衡值LD值并使用Structure软件分析群体结构，进而将各株系的结实率作为表型值输入TASSEL5.2软件，每个株系的基因型数据和表型数据一一对应，然后以1.0×10-4为阈值，采用混合线性模型MLM进行全基因组关联分析，定位影响孕穗期耐冷的QTL区间及关联SNP标记。孕穗期稳定表达耐冷QTL的鉴定。在2013年，我们共获得了4个影响孕穗期耐冷的QTL，其中在第3染色体1,824,682-1,935,593bp区间的qCT-3-2在两个试验环境下均被定位到。在2014年的进一步两地点验证试验中，该位点再次被定位到，最大置信区间为1770855-2199078bp428.2kb。来自“黄华占”的等位基因具有增强水稻耐冷特征，其四个环境下可解释的平均表型变异率为5.9％。该位点表现出不受环境影响，在孕穗期稳定的特点。表1全基因组关联分析鉴定到的稳定表达耐冷QTL4.qCT-3-2HHZ的精细定位首先利用饱和密度的SNP，筛选出5个覆盖或局部覆盖初定位区间的近等基因系并明确它们的基因型，然后采用多重T测验对5个近等基因系及“黄华占”的表型数据进行差异分析，最后综合表型和基因型结果实现qCT-3-2HHZ的精细物理定位。结果表明，qCT-3-2是一个真实存在的孕穗期耐冷QTL，位于第3染色体1823958-2150858bp之间，物理区间约为192.6kb。与来自“黄华占”的等位基因具有增强水稻耐冷特征相反，亲本PSBRC28和Phalguna的等位基因对冷害更敏感。二qCT-3-2HHZ紧密连锁新标记的发展及群体验证分析1.供试材料以黄华占，Phalguna及供体亲本为Phalguna的H8家系共计51个株系用于发展紧密连锁qCT-3-2HHZ的常规多态性标记并进行群体验证分析。2.DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳参考Temnykh等2000年的DNA提取方法，对各单株分别提取基因组DNA。使用Primerpremier5软件依据Zhu等2014提供的方法进行目标区间内部新多态性标记开发。以各个单株的基因组DNA为模板对多态性标记ZCT-7进行聚合酶链式PCR反应。PCR反应的产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，在凝胶成像系统下成像。参考双亲的扩增条带，对后代单株的带型进行判别记录。3.t测验分析根据不同株系的ZCT-7标记扩增条带所表示的基因型，将H8家系个体分成两组，一组是带有黄华占纯合基因型的个体，共计38株，记作HG基因型组；另一组是带有Phalguna纯合基因型的个体，共计13株，记作PG基因型组。将两组个体考察所得的结实率均值进行t测验图4，结果表明两组个体间的结实率达到0.001水平的极显著差异，表明ZCT-7标记附近确实存在一个水稻孕穗期耐冷基因qCT-3-2HHZ，而且与ZCT-7标记紧密连锁。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

权利要求：1.一种水稻孕穗期稳定表达的耐冷QTL的分子标记方法，其特征在于，用一对特异的PCR引物对ZCT-7，其中正向引物序列为：GGATGGTAGATTAGAAACG，反向引物序列为：ATACTACCCGAATTGTCAC，共同扩增带有品种“黄华占”血缘的育种材料基因组DNA，引物ZCT-7通过PCR扩增出与“黄华占”同样的179bp大小的片段，该育种材料含有水稻孕穗期稳定表达的耐冷QTL，所述的水稻孕穗期稳定表达的耐冷QTL位于第3染色体1823958-2150858bp之间,物理区间为192.6kb。2.根据权利要求1所述的水稻孕穗期稳定表达的耐冷QTL的分子标记方法在水稻孕穗期耐冷的分子辅助选择育种中的应用。

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