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申请/专利权人：江苏财经职业技术学院

摘要：本发明提供快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的试剂盒及其应用，试剂盒包括包被捕获抗体的酶标板、TDH标准稀释液、兔抗副溶血弧菌阴性血清、兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清、山羊抗兔IgG‑HRP的磷酸盐缓冲液、含吐温‑20的磷酸盐缓冲液、底物溶液、终止液：2molL H2SO4。本发明提供以检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素为研究对象，通过已制备的TDH毒素蛋白免疫BALBC小鼠制备抗TDH多克隆抗体，同时以致病性副溶血弧菌菌体作为免疫原免疫新西兰大白兔制备兔抗副溶血弧菌多克隆抗体，以抗TDH多克隆抗体作为捕获抗体，抗菌体多克隆抗体为检测抗体，建立双抗体夹心ELISA检测法，并运用此法检测食品中副溶血弧菌TDH毒素，研制出食品中副溶血弧菌TDH毒素ELISA快速检测试剂盒。

主权项：ELISA 试剂盒在快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素中的应用，其特征在于：包括以下步骤：（1）样本前处理：以无菌操作称取食品样品，加入0.01molL、pH7.4的磷酸盐缓冲液，于均质杯中均质，制成样品均液；将样品均液用绢纱过滤，于8000‑10000rmin离心8‑10min，取上清夜即为待检样品提取液；食品样品与磷酸盐缓冲液的用量比为25g：225mL；（2）在包被捕获抗体的酶标板的孔中，分别加入：100μL待检样品提取液、100μL TDH标准稀释液、100μL兔抗副溶血弧菌阴性血清作为阴性对照、100μL的PBST作为空白对照，封板膜封板，37℃恒温恒湿孵育60‑80min；TDH标准稀释液用以绘制标准曲线，每孔加入的TDH标准稀释液浓度分别为2μgmL、4μgmL、6μgmL、8μgmL、10μgmL、12μgmL；（3）洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干；（4）每孔中加入100μL兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清，37℃恒温恒湿孵育60‑70min；（5）洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：使用洗涤液选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干；（6）每孔中加入100μL酶标二抗山羊抗兔IgG‑HRP，37℃恒温恒湿孵育45‑55min；（7）洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干；（8）每孔中加入100μL底物溶液，30℃恒温恒湿闭光孵育15‑25min；（9）每孔中加入50μL 终止液，摇匀，5min内用酶标仪读数，参比波长设置为630nm，测量波长设置为492nm，以空白孔调零，然后读出各孔OD492值；（10）结果判断：A、定性分析：样品OD492值阴性对照平均OD492值≥2.1，判断为阳性，否则为阴性；阴性对照OD值低于0.05时，以0.05计算；高于0.05时，以实际OD值计算；B、定量分析：以OD492值为纵坐标，以TDH标准稀释液浓度为横坐标，单位μgmL，绘制标准曲线；根据样品的OD值可在标准曲线上查出待测样品TDH浓度，以此浓度乘以10即的得样品中TDH毒素含量，单位μgg；所述快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的ELISA 试剂盒，包括（1）酶标板：包被捕获抗体的酶标板；所述捕获抗体为鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清；（2）TDH标准稀释液：副溶血性弧菌TDH毒素；（3）阴性对照：兔抗副溶血弧菌阴性血清；（4）检测抗体：兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清；（5）酶标二抗：山羊抗兔IgG‑HRP；（6）空白对照液：0.01mol∕L、pH7.4的磷酸盐缓冲液；（7）洗涤液：含0.05%吐温‑20的0.01molL、pH7.4的磷酸盐缓冲液；（8）底物溶液：包括A瓶和B瓶，A瓶为含4mg100mL的邻苯二胺、pH5.0磷酸盐‑柠檬酸缓冲液；B瓶为质量百分比浓度30%的H2O2；（9）终止液：2molL H2SO4；其中，所述鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清的制备方法，包括以下步骤：将副溶血性弧菌TDH毒素分别与等量的弗氏不完全佐剂、等量的弗氏完全佐剂充分结合后，分多次、剂量递增的方法腹腔分别注射两组小鼠；基础免疫采用结合弗氏完全佐剂的4µg TDH，随后每隔2周进行1次加强免疫，制备鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清；其中，所述兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清的制备方法，包括以下步骤：在0.05%甲醛、35℃下将产TDH毒素的致病性副溶血性弧菌灭活2 h制得菌体抗原，分多次、剂量递增进耳静脉注射；免疫，免疫浓度为108CFU mL；在最后一次免疫结束后一周，耳动脉大量采血，即得兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清；其中，所述兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清的稀释度为1:4000~1:8000；所述山羊抗兔IgG‑HRP的稀释度为1:1000；其中，所述副溶血性弧菌TDH毒素的制备方法，包括以下步骤：（1）TDH毒素粗品的制备：将产TDH毒素的副溶血弧菌接种于氯化钠碱性蛋白胨水溶液中在摇床中扩大培养后，离心去除菌体，上清液中加入NH42SO4，静置盐析以充分沉淀TDH毒素；高速离心，沉淀溶解在PBS溶液中，透析，即得TDH毒素粗品；所述氯化钠碱性蛋白胨的水溶液的质量百分比浓度为3%；扩大培养条件为： 37℃、150rmin、24h；离心转速为6000rmin；NH42SO4加入量为35.1g100mL上清液；盐析条件为4℃，10h；高速离心条件为10000rmin、4℃；PBS溶液的浓度为0.010molL，pH为7.0；（2）TDH毒素粗品的纯化：（2.1）DEAE‑纤维素离子交换柱层析：将步骤（1）制得的得TDH毒素粗品缓慢滴加到DEAE‑纤维素离子交换柱中，用1L含0.2 molL 的NaCl的PBST溶液洗脱，再1L用含0.2‑1.0 mol L NaCl的PBS溶液线性梯度洗脱，收集洗脱液；加入固体NH42SO4盐析，沉淀用PBS溶解后，透析过夜；固体NH42SO4盐析的加入量为40g100mL；透析温度为4℃；（2.2）HAP柱层析：将步骤（2.1）的透析液滴加到HAP柱上，用0.5 L的含0.1molL NaCl的PBS液pH7.0洗脱，再用0.8L的0.1‑0.3molL的PBS液pH7.0洗脱，收集洗脱液；加入固体NH42SO4盐析，沉淀用PBS溶解后，透析过夜；（2.3）Sephadex G‑25柱层析：将步骤（2.2）的透析液过Sephadex G‑25柱，用0.01molL pH7.0 的Tris‑HCl缓冲液洗脱，洗脱液用PEG‑20000浓缩，即得副溶血性弧菌TDH毒素；其中，所述包被捕获抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：在新酶标板的每孔加入稀释的鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清100μL，40℃烘干后加封闭液封闭酶标板，37℃恒温恒湿孵育80min，弃去多余封闭液，使用洗涤液注满各孔，轻摇2‑4min，拍干，重复3次后扣干，即得；所述稀释的鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清为采用0.05molL、pH为9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释的血清，稀释度1:2000~1:4000；所述封闭液为质量百分比浓度3‑5%的牛血清白蛋白或3‑5%脱脂奶粉。

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